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    1. 技術服務

      假陽信號
      2020-12-01 16:44:50

      假陽性結果的特征 

          假陽性結果是樣品中沒有待檢測物時在檢測帶上出現了一條彩線(對于金標而言是紅線)。這條線可能在檢測的初期或在一段明顯的時間延遲之后出現。假信號可能在許多種樣品中發生,也可能僅僅發生在一種特定類型或來源的樣品中。 


      假陽性產生的基本原因

         在蛋白與膠體金顆粒特異性結合時,在此過程進行期間,蛋白質被三種主要的力吸收在膠體金的表面上。

      1.電荷引力:膠體金顆粒帶有負電荷,這是由于在將氯金化鈉轉化為膠體金時,使用的還原劑(經常是檸檬酸鹽)帶有的一層負電荷被吸附在膠體金顆粒的表面。負電荷將吸引帶有正電荷的蛋白并且足以使其靠近結合區的表面,這樣就有可能發生假陽性。低于等電點的蛋白帶有正電荷,因此可能會與膠體金顆粒表面發生強烈的吸引作用。尤其是帶有富含賴氨酸和精氨酸的蛋白區域在低于賴氨酸的等電(pH10.4)和精氨酸的等電點(pH12.5)時會帶有大量的正電荷。 


      2.疏水作用力:一旦蛋白質彼此十分接近(之間的距離大約小于1nm),蛋白質的任何疏水區很有可能與膠體金表面的疏水區接觸并且與之結合。因此富含非極性氨基酸(例如色氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸)的蛋白質會與膠體金表面發生強結合作用。


      3.配位鍵結合力  配位鍵結合力是所有吸引力中最強的結合力。含有大量富含硫的氨基酸(由于存在半胱氨酸和甲硫氨酸)的蛋白質強結合膠體金顆粒表面。這是由于在金原子(具有傳導帶電子的能力)和硫原子(帶有價電子)之間的吸引力造成的。當這三種結合力作用于金標顆粒上,它們會產生如下所述的假陽性信號并且由此而對檢測技術的效能產生不良的影響。


      由于金標粒子而產生的問題 

          由于某種原因金標粒子的表面由于沒有被蛋白質覆蓋而會部分裸露。在干燥金標液或者在檢測過程中,或者在第一步中金標被涂得很少,這些都有可能導致抗體被去除。無論哪種原因,裸露的膠體金顆粒將會被任何帶有正電荷的蛋白質或硝化纖維素或尼龍膜所吸引。當膠體金顆粒通過捕捉線,由于距離非常小而物理接觸的可能性的非常大,這特別明顯。因此有效地包被膠體金顆粒并且蛋白質在儲存、處理或操作的過程中沒有脫落,這兩點是非常重要的。

          除了膠體金顆粒對捕捉線的吸附外,標記抗體本身可能在特定的操作條件下被捕捉線吸附。這可能歸結于電荷或疏水作用力,也可能是由于在此過程中的酸性或離子環境。 過量的金標粒子會產生幾個問題。首先,它能夠提高在捕捉線上假陽性信號的可能性,或則是由于大量的金標液通過這條線。其次,在檢測期后,它也會提高膠體金標粒子回流的可能性。膠體金顆粒也可能聚集成簇,一般來說有很多原因,通常是由于操作失誤所致。膠體金簇如果多的話可能會堵塞膜孔。如果成簇的原因是由于膠體金的疏水作用力形成的,那么在金標液流動的過程中膠體金顆粒也會粘附在捕捉抗體上。


         無論待測物是否存在,金標的抗體都可能會與捕捉抗體發生非特異性免疫反應。但是這種方法會使硝酸纖維素膜上的標記抗體與捕捉抗體非常接近,從而提高了發生非特異性免疫反應的可能性。另外,特別是在使用多克隆抗體時,有可能會發生與樣品中其它待測物的非特異性的反應,這種非特異性反應的發生與否主要取決于使用的抗體的純度。 


      與固相支持物相關的問題

         硝酸纖維素膜非常脆并且在接觸時很容易受到破壞。因此在撕開膜的過程中避免與膜發生任何可能的機械接觸是非常重要的。如果應用捕捉抗體時膜被壓制在捕捉抗體帶上,那么在樣品流動過程中,會提高金標粒子發生非特異性反應的可能性。兩個方面能夠使殘余的金顆粒附著在捕捉抗體帶上——金標粒子在膜中的流速太慢或者是膠體金墊釋放的速度太慢。如果膜的孔徑太小或者在檢測帶上沒有足夠的活性物質,再就是硝酸纖維素膜與金標液或與吸收墊的接觸不良,那么這些情況就會發生。

         此外,由于硝酸纖維素膜是疏水的,因此會阻礙金標液順暢的流動。有些樣品可能非常具有粘性的(例如血清),這種因素也會使流速減慢。當檢測體系中沒有足夠的樣品或活性物質來使金標沿著檢測帶移動時,膠體金顆粒也會粘附在捕捉抗體帶上。如果花費很多時間來觀測檢測結果(通常是超過15分鐘)時,膜就會變干,多余的金標粒子很有可能開始從吸收墊向干燥后膜回流。由于干燥后的捕捉抗體非常疏水,膠體金顆粒從吸收墊流向干燥后的捕捉抗體帶的可能性非常高。


      化學試劑問題 

          封閉的生產環節,  在干燥的狀態下這種封閉作用可能會讓膜具有更強的疏水性,因此甚至能在捕捉抗體帶引起更為普遍的背景染色或假陽性信號。采用過量的蛋白或活性劑進行封閉的方式都能夠在樣品流動過程中產生高粘性。 

          一些保護劑,不論在捕捉抗體中的、標記抗體中的或者是樣品中的都能產生假陽性結果。硫柳汞(含硫和汞的化合物)和賴氨酸(一般pH<10.4下帶有大量的正電荷)在檢測中是特別要注意的問題。 


      對假陽性結果診斷的補救措施 

          最明顯的原因首先是被注意到的,主要有金標與捕捉抗體的反應;特異性電荷吸引力、疏水作用力和金-硫結合力。然后應當注意在抗體、特殊樣品特性和跨膜流動特性的非特異性交叉反應。

      1.是電荷的原因嗎?檢測體系pH值的變化(pH5~11)表明了正電荷是否存在和膠體金顆粒與捕捉抗體是否結合。 

      2.是疏水作用力的原因嗎?這可能發生在固相中,捕捉抗體區或金標區。改變體系中活性劑濃度對于疏水作用是否是主要因素可以提供頭緒 

      3.是金-SH吸引的原因嗎?最有可能發生在捕捉抗體帶和樣品浸入帶中的半胱氨酸和精氨酸的基團中。


      對于假陽性問題解決的系統方法 

      1. 產生的問題是與金標液相關嗎?這個問題很好解決,換一種金標液就可以了—舉例來說,在相同濃度和相同的pH值下用BSA-gold替換最初的金標液。 如果問題還是沒有消除,那么最為可能的原因是所帶的電荷效應。如果換了金標液后不再產生假信號,那么問題產生的原因最可能是最初的金標液的問題或者是標記抗體的問題。在這里其他的對照是相似的金標液和含有單克隆抗體和多克隆抗體的金標液。

         下面是一個由于金標液而產生的假陽性信號的例子。應用的是針對于臨床樣品(血清)檢測傳染性疾病的檢測條。在所有的非陽性樣品中都看到了假陽性結果。當使用BSA-gold金標液后,假陽性信號消失了。而使用了另一種非特異性金標液后,假陽性信號也消失了。然而,當更換了非臨床對照樣品,PBS在pH7.2下,使用特異性金標液假陽性信號仍然存在,在使用其它的金標液則沒有假陽性信號。改變緩沖液的pH值為10后,減少了假陽性信號的發生,但是并沒有消除假陽性信號。因此我們可以得出結論,問題的產生與樣品或捕捉抗體無關,而是與對捕捉抗體一行的高靈敏度的金標液有關。這些金標很可能含有裸金顆粒,這可能與捕捉抗體發生結合。

      2. 是捕捉抗體的原因嗎?在這種情況下使用的對照是相似的捕捉抗體或其它種類的抗體。然而在使用這些對照前,剝去BSA捕捉蛋白可以說明是不是其它地方產生的問題。也有可能不是由于抗體本身而產生假陽性信號,而是由于在抗體中的一些保護劑的原因。在這種情況下,在適宜的緩沖液(例如10mmolPO)中進行透析可以改善情況。如果用了其它的抗體假陽性信號消失了,那么顯而易見是特異性捕捉抗體引起了假陽性信號,采取的措施是更換抗體或者清除它。舉個例子,在實際操作中,兔的單克隆抗體有時會產生這種情況,這主要是由于疏水力的作用,需要采用特別的方法來處理。(Sg全血輔料) 

      3. 是膜的問題嗎?任何檢測帶的開發中最重要的過程是選擇合適的膜。有些膜與其它的膜相比而言可能只適于特定類型的檢測或者只適合于特定的樣品。開發商應當有所有廠家的各種膜并且有各種孔徑的膜,這樣才能做出迅速的比較。舉例來說,在干燥的過程中膜的疏水性是顯而易見的,因此我們可以清楚的知道這批次的膜會產生隨機的假陽性信號。在選擇快速檢測技術所用的膜時不僅應當

      4. 是化學藥品的原因嗎?在快速檢測帶的組裝過程中,金標液和固相支持物(膜、結合墊或樣品墊)可能用化學試劑預先處理過。所加的化學試劑可以包括鹽、活性劑、蛋白質、糖和聚合物。一些化學物質能夠提高假陽性的幾率。 

      考慮到所要求的流速和蛋白結合特性,而且要考慮到在制備過程中膜的均質性。在這里需要用的對照是不同孔徑和不同來源的膜,還有就是同一批次的膜的不同區域。 

      5. 是樣品的原因嗎?由于酸度、樣品污染等諸如此類的因素的變化,正如前所述,樣品能夠引起不可預知的假陽性信號。最簡單調整的方式是改變樣品的酸度,這種方法可以很快確定是否是樣品中電荷吸引力的作用而產生的問題。也可能需要對樣品進行過濾,過濾得步驟可以獨立于檢測程序,也可以作為檢測步驟的一部分而使用。


      檢測中異常情況原因分析

      對于個別情況導致的假陽性,可能為以下原因引起。例如:

           1、血液樣本為高血脂、高血紅蛋白、高度乳糜血等異常血樣,可能會引起非特異性吸附,以致出現細線或假陽。

           2、離心不夠徹底、樣本存放時間過長會產生一些細胞部分被破壞成細胞碎片,疏水的細菌碎片可能與捕捉抗體和金標顆粒發生交叉反應而導致假陽。

           3、操作方法 如果是直接加樣的情況,加樣量一定要足夠,否則易導致假陽;如果選擇將試劑條插入樣本的方式,則不能超過MAX線,否則易導致假陽。

         4、觀察時間的延長,導致金標物質的持續釋放,過量的抗原抗體造成假陽情況。


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